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如何提高RNA提取质量

作者:佚名    发布日期:2017-07-17 09:00

如何提高RNA提取质量

 

1.在收获组织及细胞死亡之后,应立即灭活内源的 RNA 酶,以防止 RNA 降解。

以下 3 个方法均可有效使内源 RNA 酶失活:

1)用含离液(如胍盐)的细胞裂解液收获样品,并立即匀浆;

2)用液氮瞬间冻结样品。值得特别注意的是:组织块必须保证足够小,在浸入液氮的瞬间就能冻结,以确保瞬间令 RNA 酶失活;

3)立即将样品置于 RNAlater:RNA Stabilization Reagent QIAGEN(虎途娱乐老虎机_虎途娱乐在线_虎途娱乐官网代理)。它是一种水相、无毒的收集试剂,能立即稳定并保护完整、未冻结的组织和细胞样品中的 RNA。关键要点是组织样品切片一定要够薄(<0.5 cm),这样 RNAlater 才能在 RNase 破坏 RNA 之前迅速渗入组织块中。


2.使用正确的细胞或组织储存条件

在样品用液氮瞬间冻结之后,应该储存在-80°C,千万不能解冻。即使是置于含有胍盐的裂解液中作匀浆前的短暂解冻,也会导致 RNA 的降解和损失。瞬间冻结的组织应该首先在超低温条件下先研磨成粉,然后置于裂解液中进行匀浆。


RNAlater 使样品储存更为便利。储存在 RNAlater 中的细胞或组织可在室温下稳定保存长达 1 个星期,在 4°C可稳定保存长达 1 个月,或永久保存在-20°C。

 

3.彻底匀浆样品

细胞或组织的彻底匀浆对 RNA 提取来说,是一个很关键的步骤,它能够防止 RNA 的损失和降解。匀浆的方法应根据细胞或组织的类型来选择。大部分培养的细胞可以置于细胞裂解液中,通过简单的涡旋震荡来匀浆;而动物组织、植物组织、酵母和细菌则常常需要更加剧烈的方法。比如说细菌的细胞壁,就需要酶消化来实现彻底的细胞裂解和 RNA的最大回收。有关各种不同的样本类型,哪些方法是最适合的匀浆方法,请参考 虎途娱乐老虎机_虎途娱乐在线_虎途娱乐官网


4.在 RNA 提取之前预处理样品裂解液

对于某些样品来说,在匀浆之后,RNA 提取之前,还需要一些额外的处理步骤。对于脂肪含量高的组织,像脑组织和脂肪组织得到的裂解液,就需要通过氯仿抽提来去除脂类,从而提高 RNA 产量。


5.选择最好的 RNA 分离方法

现有众多的 RNA分离方法也许令人难以取舍。目前最简单也是最安全的方法是柱式分离,因为操作简单,所以这些步骤特别适用于同时处理多个样品。如果是处理复杂的组织,如富含核酸酶(胰腺)或脂肪(脑和脂肪组织)的样品,就推荐使用更加严格的、基于酚处理的 RNA分离方法。


6.DNase 处理

如果提取的 RNA 将用于 RT-PCR,我们推荐用 DNase 处理纯化的 RNA 样品以去除残留的 DNA 污染。洗脱之前加步DNase消化步骤。


7.减少环境 RNase 的暴露

为了得到完整的、高品质 RNA,在整个 RNA 制备过程中,当 RNA 离开强蛋白变性剂(如离液裂解液或酚)的保护时,避免引入新的 RNase 污染就非常关键。由于 RNase 几乎是无所不在,所以必须确保与纯化的 RNA接触的每一样东西都是无 RNase 污染的。所有的表面,包括移液器、工作台、璃器皿和制胶设备,都必须用表面去污净化溶液如DEPC 处理过。必须保证一直使用无 RNase 的枪头、试管和溶液,手套也应经常更换。


8.正确的沉淀

纯化得到的 RNA 可能需要通过沉淀来浓缩,以满足一些下游应用的需要。虎途娱乐老虎机_虎途娱乐在线_虎途娱乐官网RNA提取试剂盒与纯化柱离心技术相结合。与传统的 RNA 分离技术不同,该柱无需乙醇沉淀、无需昂贵的树脂、 无需有害的有机试剂如酚、氯等,且可同时操作多个样本。RNA 结合在硅胶膜上,溶解的蛋白与 PCR 抑制物则被过滤除去,得到RNA直接用于下游实验。


9.重悬

许多 RNA 提取步骤的最后一步是溶解纯化的 RNA 沉淀。理想的重悬溶液应该满足 3 点要求:无 RNase 污染、较低的 pH 值(pH 6-7)、含有螯合剂,以保护 RNA 不受带入的 RNase 的降解。虎途娱乐老虎机_虎途娱乐在线_虎途娱乐官网RNA提取试剂盒包含洗脱液,洗脱得到的RNA直接用于下游实验。

 

10.储存

如果只是短期储存,重悬的 RNA 应放置于-20°C;如果是长期储存的话,就应该放置于-80°C。


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70-MK020001-250 Trizol 柱总 RNA 纯化试剂盒 I Trizol Total RNA Purification Kit I 250 T 2925
70-MK0201-050 全血总 RNA 纯化试剂盒 Blood Total RNA Purification Kit 50 T 1200
70-MK0201-250 全血总 RNA 纯化试剂盒 Blood Total RNA Purification Kit 250 T 5400
70-MK0203-050 培养细胞总 RNA 纯化试剂盒 Cultured Cells Total RNA Purification Kit 50 T 1000
70-MK0203-250 培养细胞总 RNA 纯化试剂盒 Cultured Cells Total RNA Purification Kit 250 T 4500
70-MKF01050401-050 快速质粒 DNA 小量纯化试剂盒 Fast Plasmid DNA Purification mini Kit 50 T 150
70-MKF01050401-250 快速质粒 DNA 小量纯化试剂盒 Fast Plasmid DNA Purification mini Kit 250 T 650
70-MK0601-025 cDNA 反转录试剂盒 cDNA Reverse Transcription Kit 25 T 600
70-MK0601-100 cDNA 反转录试剂盒 cDNA Reverse Transcription Kit 100 T 2700


以上文章 原文来自丁香园-如何改善RNA提取质量

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